細(xì)胞增殖測定廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒性研究、癌癥研究和細(xì)胞生物學(xué)的許多其他領(lǐng)域。其中許多可以通過熒光標(biāo)記對增殖細(xì)胞進(jìn)行可視化，并且適合高通量篩選。

檢測復(fù)制的 DNA 可以說是檢測增殖的最直接方法。這是通過使用溴脫氧尿苷 (BrdU)核苷實現(xiàn)的，該核苷在復(fù)制過程中融入 DNA。然后，細(xì)胞 DNA 中的這些核苷修飾可以通過抗 BrdU 抗體檢測到。盡管具有特異性，但這種測定方法繁瑣且難以重現(xiàn)，因為需要用刺激性試劑處理細(xì)胞，以使 DNA 暴露于抗體，否則這些抗體不會穿透細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

一種更溫和的替代方案是乙炔基脫氧尿苷 (EdU)，可以通過將其添加到培養(yǎng)基中或注射到動物體內(nèi)來將其遞送至細(xì)胞。摻入 DNA 后，該核苷可在銅 (I) 催化下與各種熒光染料疊氮化物結(jié)合，從而對復(fù)制的 DNA 進(jìn)行熒光染色。該測定易于執(zhí)行、快速且可重復(fù)。它不需要對細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)酷的處理（只需要用 Triton 進(jìn)行透化），因此可以更好地保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在用疊氮化染料處理和最后的洗滌步驟（步驟 8）后，可以使用具有各種發(fā)射波長的熒光團(tuán)（例如 Hoechst、DAPI或熒光標(biāo)記抗體）來標(biāo)記細(xì)胞。

所需試劑

• 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷 (EdU)

• 銅 (II)-BTTAA 絡(luò)合物— сlick сhemistry 催化劑

• 抗壞血酸— 銅的還原劑

• 疊氮化物熒光染料

• DMSO，標(biāo)簽級— 疊氮化物溶劑

• Triton X-100（或 Tween-20）

• PBS，pH 7.4

• 100 mM Tris 緩沖液，pH 7.4

協(xié)議

確切的方案取決于特定的細(xì)胞或組織類型，但一般工作流程如下所述：

1. 將細(xì)胞/組織與 10–20 μM EdU 孵育所需的時間。

2. 用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定細(xì)胞 15 分鐘。

3. 用 PBS 清洗細(xì)胞。

4. 用含有 0.2% Triton X-100（或 0.5% Tween-20）的 PBS 透化細(xì)胞 30 分鐘。

5. 再次用 PBS 清洗細(xì)胞。

6. 在 100 mM Tris 緩沖液，pH 7.4（對于磺化疊氮化物）或 100 mM Tris 緩沖液，pH 7.4（含 50% DMSO）中制備含有 2 mM 銅 (II)-BTTAA 復(fù)合物、10 mM 抗壞血酸和 5 μM 疊氮化染料的混合物（對于非磺化疊氮化物）。該混合物應(yīng)新鮮制備，因為銅 (I) 在水溶液中不穩(wěn)定。

7. 將細(xì)胞與點擊反應(yīng)混合物一起孵育 30 分鐘。

8. 用 PBS 清洗細(xì)胞。

9. （可選）如果細(xì)胞必須用不同的熒光團(tuán)標(biāo)記，請使用標(biāo)準(zhǔn)方案繼續(xù)染色。

磺化（水溶性）疊氮化物，例如磺基氰疊氮化物和 AF 疊氮化物，可產(chǎn)生最佳效果。當(dāng)使用非磺化疊氮化物（例如氰疊氮化物或 BDP 疊氮化物）時，確保反應(yīng)混合物中 DMSO 濃度為 50%。